Сероводород в ЦНС рака богомола (Oratosquilla oratoria) в условиях аноксии

УДК 595.382:591.48

Е. П. Коцюба
Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток, Россия

E. P. Kotsyuba
A. V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok, Russia

Сероводород (H2S) также как оксид азота (II) и монооксид углерода является газообразным нейромодулятором в мозге позвоночных животных и человека, участвующим в регуляции гомеостаза в норме и при патологических состояниях (Wang, 2002). Эндогенно он синтезируется в нервной системе из L-цистеина CBS. Сравнительно недавно появились данные о нейропротекторной роли H2S при гипоксии мозга у позвоночных (Tay et al., 2010). У беспозвоночных животных наличие эндогенного сероводорода достоверно установлено у нескольких систематических групп, однако о роли этой нейротрансмиттерной системы при кислородной недостаточности в нервной системе ракообразных мало известно. В связи с загрязнением морских экосистем возникает необходимость исследования роли H2S-ергических механизмов в организации приспособительных реакций у толерантных к гипоксии видов. Цель работы – оценить количественное распределение и динамику активности CBS в ЦНС рака богомола Oratosquilla oratoria (De Haan, 1844) (Stomatopoda, Squillidae) при аноксии.

Работа выполнена на взрослых особях раков богомолов O. oratoria, размером 150–155 мм, отловленных в заливе Петра Великого (Японского моря). Экспериментальную аноксию создавали, выдерживая животных на воздухе при температуре +18 ºС и 100 % влажности в течение 1, 6 и 12 ч. Контрольную группу раков богомолов содержали в аквариуме с аэрируемой морской водой при температуре +18 ºС. Для иммуногистохимии головной и туловищный мозг раков фиксировали 1 ч в 4 % растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) при +4 ºС через 1, 6 и 12 ч. CBS выявляли на криостатных срезах, используя моноклональные антитела мыши (Abcam, Великобритания), в разведении 1:500 согласно методике, которая описана нами ранее (Коцюба, 2011). Для иммуноблоттинга свежевыделенные головной и туловищный мозг гомогенизировали. Электрофорез белков проводили в 12 % полиакриламидном геле по методу Леммли (1970). Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали в 4 % растворе обезжиренного сухого молока. Далее мембрану последователь¬но инкубировали с моноклональными антителами против CBS мыши (разведение 1:1000; Abcam, Великобритания), с вторичными антителами (Vectastain, США) и с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite АВС Kit, Vector Labs, США) по 1 ч при +22 ºС. Далее мембрану окрашивали диаминобензидином (MP Biomedicals, США), сканировали и анализировали программой Image J.

Результаты исследования показали наличие CBS в ЦНС как контрольных, так и экспериментальных O. oratoria. После 1 ч аноксии в гомогенатах головного и туловищного мозга при вестерн-блоттинге наблюдается повышение содержания CBS по сравнению с контролем. При иммуногистохимическом исследовании в этот период выявляется достовер-ное повышение активности фермента только в нейронах головного мозга и подглоточного ганглия, при этом относительное число CBS-позитивных клеток в ЦНС достоверно не изме-няется. После 6 ч аноксии по сравнению с контролем выявляется достоверное повышение уровня CBS во всех отделах ЦНС и увеличение доли CBS-позитивных клеток в 6, 9, 11, 16 и 17 группах в мозге, в латеральных группах подглоточного ганглия, в грудных и абдоминальных ганглиях. Через 12 ч наблюдается выраженное снижение содержания СВS и уменьшение доли СВS-позитивных нейронов в головном и туловищном мозге. Сравнительный анализ данных показал, что снижение активности СВS более выражено в мотонейронах грудных и абдоминальных ганглиев, чем в подглоточном.

В настоящее время установлена зависимость между уровнем содержания H2S в нервных клетках и развитием различных патологических процессов. Высказывается мнение (Garcia-Bereguiain et al., 2008), что H2S является основным модулятором кальциевого гомеостаза в нейронах, активируя поступление ионов кальция в цитозоль через Ca2+ каналы L типа. Нарушение этого процесса сопровождается разнообразными изменениями в работе нервных клеток и, прежде всего, их сигнальной функции. Известно, что концентрация H2S в тканях повышается только в ответ на специфическую стимуляцию, причем локально и кратковременно, а затем быстро снижается, расщепляясь ферментами или вступая во взаимодействие с рядом соединений, в том числе, такими токсичными для клеток, как супероксидный радикал, перекись водорода, перексинитриты и т.д. (Carballal et al., 2011). Сравнительно недавно в лабораторных экспериментах получены данные, что донор сероводорода NaHS оказывает нейропротекторный эффект на нейроны при гипоксии мозга (Tay et al., 2010). Обнаружено, что в механизмах защиты нервных клеток важную роль играют АТФ-зависимые калиевые каналы (Dawe et al., 2006). Роль H2S-ергической системы у ракообразных мало изучена. Однако известно, что в нейронах млекопитающих гипоксия вызывает повышение уровня H2S. Сходные данные получены на нематодах Caenorhabditis elegans (Budde et al., 2009). Проведенное нами исследование показало, что у рака богомола O. oratoria CBS-позитивные клетки присутствуют во всех отделах ЦНС. При гипоксии наиболее значительные изменения в содержании CBS-позитивных нейронов наблюдается в протоцеребруме, который играет важную роль в интегративных процессах ЦНС, формировании двигательных программ поведения, механизмах контроля и регуляции активности моторных центров при экстремальных ситуациях (Shirinyan et al., 2006), и в подглоточном ганглии, где располагаются вегетативные центры ракообразных. После 12 ч аноксии уменьшается активность CBS во всех отделах туловищного мозга в сегментарных мотонейронах грудных и абдоминальных ганглиев, которые участвуют в иннервации сегментарной мускулатуры.

Таким образом, изменение активности CBS в нервных центрах головного и туловищного мозга у O. oratoria при аноксии позволяет предположить, что одной из неспецифических защитных реакций при гипоксии является изменение активности H2S в сегментарных и надсегментарных центрах, обеспечивающих различные локомоторные акты.


Zoocenosis — 2013
Біорізноманіття та роль тварин в екосистемах: Матеріали VІІ Міжнародної наукової конфе ренції. – Дніпропетровськ: Адверта, 2013. – С. 54-56.

Розповісти колегам:

Опубликовать в Google Plus
Опубликовать в LiveJournal
Опубликовать в Мой Мир
Опубликовать в Одноклассники