Детекция представителей Diplomonadida (Hexamitidae) в лососевидных рыбах озера Байкал молекулярно-генетическим методом
УДК 575.22:593.16:597.553.2
Н. Л. Белькова*, Е. В. Дзюба*, Е. В. Суханова**
*Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Российская Федерация, belkova@lin.irk.ru
**Иркутский государственный университет, Иркутск, Российская Федерация
DETECTION OF DIPLOMONADIDA (HEXAMITIDAE)
IN SALMONOIDEI FROM THE BAIKAL LAKE
BY MOLECULAR-GENETIC METHOD
N. L. Bel’kova*, E. V. Dzyuba*, E. V. Sukhanova**
*Limnological Institute SD RAS, Irkutsk, Russia, belkova@lin.irk.ru
**Irkutsk State University, Irkutsk, Russia
Гексамитоз – инвазионное заболевание лососевых рыб, выращиваемых в искусственных условиях. Регистрируется также у налима и стерляди. Возбудителем гексамитоза являются представители семейства Hexamitidae. Локализуются паразитические жгутиковые в желчном пузыре и передней части кишечника хозяина, свободно плавая с помощью жгутиков в содержимом этих органов. Размножается паразит прямым делением, но может образовывать и цисты, которые выводятся из организма хозяина. Заражение рыб происходит при заглатывании этих цист при питании или с водой. Гексамитозом болеют все виды лососей, но наиболее восприимчива к заболеванию их молодь. Рыбы старших возрастов болеют меньше (кроме форели) и служат источником инвазионного начала для молоди. Наиболее часто болезнь возникает при ослаблении организма рыбы неблагоприятными условиями содержания и кормления.
Для лососевидных рыб специфичным паразитом является Spironucleus barkhanus Sterud, Mo, & Poppe, 1997 (Diplomonadida, Hexamitidae) – паразитический эукариотический организм, существующий в двух морфологически подобных типах. Первый – пресноводный тип, выделен из кишечника и желчного пузыря европейского хариуса Thymallus thymallus, а также желчных пузырей сибирского хариуса Thymallus arcticus и арктического гольца Salvelinus alpinus, и не вызывает заболевания хозяина. Второй – морской тип, вызывает серьезные системные инфекции у выращиваемых в аквакультуре рыб, таких как атлантический лосось Salmo salar и арктический голец (Норвегия), чавыча Oncorhynchus tshawytscha (Канада) (Mo et al., 1990; Kent et al. 1992; Sterud et al., 1998 и др.). Периодические вспышки заболеваний лососевых рыб, вызванные представителями рода Spironucleus приносят огромные убытки рыбоводческим хозяйствам (Jorgensen, Sterud, 2006).
Черный байкальский хариус (Thymallus arcticus baicalensis Dybowski, 1874) – эндемичный байкальский подвид, распространен в Байкале по всему побережью и в притоках озера. Байкальский омуль (Coregonus autumnalis migratorius) – ценный промысловый вид, акклиматизирован в ряде водоемов Европы и Азии (Сиделева, 2004). В литературе отсутствуют данные о находках S. barkhanus в рыбах байкальского региона. При исследовании микрофлоры желудочно-кишечного тракта черного байкальского хариуса из р. Ангара нами кроме бактериальных, получены последовательности S. barkhanus (Белькова и др., в печати). В связи с чем, цель настоящего исследования – оценить ареал распространения S. barkhanus в лососевидных рыбах озера Байкал молекулярно-генетическим анализом.
Материалом для отработки метода послужили рыбы из различных районов озера Байкал: черный байкальский хариус (Южная котловина озера (падь Кедровая), о-в Ольхон, Ушканьи о-ва, м. Орловский) и байкальский омуль пелагической (Южная котловина) и прибрежной (Северная котловина) морфоэкологических групп. Для анализа взяты как свежеотловленные, так и замороженные при температуре –18°С рыбы разных возрастных групп (половозрелые и сеголетки). Для выделения суммарной ДНК взяты фрагменты кишечника с остатками пищи (переваренные амфиподы) и желчные пузыри. Выделение суммарной ДНК из образцов проводили методами ферментативного лизиса с фенол-хлороформной экстракцией и модифицированной цетавлоновой очистки. Суммарную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции на паре праймеров Spiro-1F– Spiro-2R (Jorgensen, Sterud, 2004). Режим реакции включал 30 циклов амплификации: денатурация +94°С – 45 с, отжиг +55°С – 45 с и элонгация +72°С – 60 с. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе Beckman Coulter CEQ 8800 Genetic Analysis System в Иркутском приборном центре коллективного пользования СО РАН. Сравнительный анализ последовательностей проводили с помощью пакета программ BLASTA (www.ebi.ac.uk/blastall/nucleotide.html). Филогенетическое древо строили с помощью пакета программ Mega v3.1.
Генетический анализ представителей S. barkhanus, выделенных из рыб, обитающих в природных и искусственных условиях, выявил принципиальное отличие их генотипов (Jorgenson, Sterud, 2006). Было показано, что каждая из двух его морфологически подобных форм имеет определенного хозяина (Jorgenson, Sterud, 2004, 2006). Мы провели сравнительный анализ последовательностей, полученных из кишечника хариуса с известными последовательностями, выделенными из лососевидных рыб водоемов Канады и Норвегии. Результаты показали, что байкальский представитель S. barkhanus идентичен изолятам S. barkhanus, выделенным из таких рыб как европейский хариус (DQ186573–DQ186579, DQ186581, DQ186584, DQ186587) и арктический голец (DQ186580, DQ186582, DQ186589–DQ186592 и AY646679). На филогенетическом древе нуклеотидные последовательности байкальских представителей S. barkhanus образуют кластер вместе с другими непатогенными S. barkhanus. В то время как изоляты, имеющие патогенный генотип, с высоким показателем бутстреп анализа образуют отдельный кластер. Недавно они были реклассифицированы в новый вид S. salmonicidida n. sp. (Jorgensen, Sterud, 2006).
Следующим этапом работы стала видоспецифичная амплификация препаратов суммарной ДНК из желчных пузырей и кишечников рыб на праймерах, предложенных и апробированных ранее А. Йоргенсеном и Е. Стерудом на изолятах Spironucleus barkhanus (Jorgensen, Sterud, 2004). Авторами были разработаны пары праймеров для амплификации как патогенных (Spnuc-1F–Spnuc-2R), так и непатогенных (Spiro-1F–Spiro-2R) представителей S. barkhanus. Для оптимизации видоспецифичной ПЦР с суммарной ДНК проведен поиск оптимальных концентраций матричной ДНК и условий проведения амплификации. Нами показано, что оптимальной является температура отжига +55°С для праймеров Spiro-1F–Spiro-2R и 30 циклов амплификации. В результате амплификации на видоспецифичных праймерах получен ПЦР-продукт на паре Spiro-1F–Spiro-2R, которые являются специфичными для непатогенного генотипа. Следует отметить, что положительный результат на видоспецифичных праймерах был получен на препаратах суммарной ДНК, выделенной как из желчного пузыря, так и кишечника рыб.
В замороженных образцах хариуса S. barkhanus не был детектирован на видоспецифичных праймерах. Положительный результат получен при анализе только свежеотловленных половозрелых хариусов из района мыса Орловский (Средняя котловина озера).
Детекция S. barkhanus в свежеотловленном байкальском омуле пелагической морфоэкологической группы показала положительный результат, как у половозрелых особей, так и у сеголеток. В образцах половозрелого омуля прибрежной морфоэкологической группы S. barkhanus не был детектирован.
Таким образом, нами показана принципиальная возможность молекулярно-генетической детекции S. barkhanus, который у лососевидных рыб озера Байкал выявлен впервые. Филогенетический анализ и видоспецифичная амплификация показали его идентичность с непатогенными представителями S. barkhanus из лососевых рыб, обитающих в пресных водах. В настоящий момент становится очевидным необходимость молекулярно-генетической детекции S. barkhanus в других видах лососевидных рыб из озера Байкал и других водоемов Сибири для уточнения ареалов его распространения.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 05-04-97221-р-байкал-а,
№ 07-04-00883-а.
Zoocenosis — 2007
Біорізноманіття та роль тварин в екосистемах: Матеріали ІV Міжнародної наукової конференції. – Дніпропетровськ: Вид-во ДНУ, 2007. – С. 322-324.