RAPD-изменчивость плотвы, леща, их гибридов F1 и бэккроссов
УДК 597.554.3:575.175
В. В. Столбунова, Ю. В. Слынько
Институт биологии внутренних вод Российской академии наук,
Борок, Российская Федерация, vvsto@mail.ru
RAPD-VARIABILITY OF ROACH, BREAM,
THEIR F1 CROSSES AND BACKCROSSES
V. V. Stolbunova, U. V. Slinko
Institute of Biology of Inland Waters, RussianAcademy of Sciences,
Borok, Russia, vvsto@mail.ru
Среди позвоночных животных явление межвидовой гибридизации наиболее часто встречается у рыб. Это связано с водной средой обитания, наружным оплодотворением икры и действием антропогенных факторов, изменяющих условия обитания промысловых видов. Объектами нашего исследования являются представители семейства карповых – несомненного рекордсмена по числу обнаруженных случаев естественной межвидовой гибридизации. Среди наиболее массовых представителей этого семейства – плотва (Rutilus rutilus L.) и лещ (Abramis brama L.) – численность межвидовых гибридов в отдельных популяциях может достигать 80 % (Fahy et al., 1988). Фертильность гибридов первого поколения неоднократно подтверждена в экспериментах и полевых наблюдениях. У гибридов диагностические морфологические признаки отцовского и материнского видов, как правило, выражены в равной степени. Реципрокные варианты гибридов F1 характеризуются значительной перекрывающей у вариантов морфологической изменчивостью, а диагностические аллозимные признаки представлены гетерозиготами, неразличимыми между реципрокными вариантами. Все это затрудняет идентификацию гибридных генотипов с использованием морфологических и генетико-биохимических признаков. В связи с этим мы попытались применить новые для плотвы, леща и реципрокных гибридов молекулярно-генетические маркеры, а именно RAPDs. В настоящей работе RAPD-анализ использовали для идентификации и генетической дифференциации чистых видов (плотва, лещ) и их межвидовых гибридов F1 и бэккроссов, полученных путем искусственного скрещивания.
Для выделения тотальной ДНК использовали венозную кровь. Забор крови производили из хвостовой вены, затем консервировали в 0,05 М растворе ЭДТА (рН = 8,0) и хранили при температуре +4°С. Выделение ДНК проводили с помощю набора Diatom100. Для выявления геномной вариабильности использовали шесть случайных праймеров следующего состава: ОРА11 – 5’-CAATCGCCGT-3`, OPA17 – 5`-GACCGCTTGT-3, OPA19 –
5-`CAAACGTCGG-3`, P29 – 5`-CCGGCCTTAC-3`, OPA20 – 5`-GGTCTAGAGG-3`, SB2 –
5`-GACGGCCAGTATT-3`. Реакцию амплификации со случайными праймерами осуществляли на термоциклере Терцик. Реакционная смесь обьемом 25 мкл содержала 67 мМ трис-НСI (pH = 8,8), 16,6 мМ сульфата аммония, 0,01 % твин-20, по 0,3 мМ каждого dNTP, 60 мМ МgCl, 1 мкМ праймера, 0,9 ед. Tag-полимеразы и 25–100 нг тотальной ДНК. Каждый цикл полимеразной реакции состоял из денатурации (+94°С, 2 мин.), отжига (+45°С, 1 мин.), элонгации (+72°С, 2 мин.). Циклы повторялись 35 раз, первый цикл предваряли денатурацией в течение 5 мин. при температуре +94°С. После окончательной достройки амплифицированной ДНК (+72°С, 2 мин.) прибор снижал температуру до +4°С. Продукты амплификации подвергали элекрофорезу в 1,5 % агарозном геле толщиной 7–10 мм, содержащем бромистый этидий. В качестве маркеров молекулярной массы использовали 100 p и 1 kb Ladder «Fermentas».
Каждый из праймеров выявлял в индивидуальных спектрах плотвы, леща и гибридов от 7 до 21 фрагмента размером 250–1000 п. н., при этом наименьшее число фрагментов выявлял праймер ОРA-20 (7), наибольшее – OPA-17 (21). Число фрагментов (Ν) в индивидуальных спектрах, детектируемое с помощью шести праймеров – от 51 до 79, наибольшее число локусов выявлено в группе П*ПЛ (L – 138), наименьшее – в группе ЛЛ (L – 106). Получены следующие данные по средним значениям фрагментов в индивидуальных спектрах для плотвы, леща и гибридов ПЛ, ЛП, П*ПЛ, П*ЛП, ПЛ*П: 71,8 ± 2,3, 64,8 ± 4,7, 70,0 ± 5,5, 59,0 ± 7,8, 72,2 ± 5,4, 73,6 ± 1,9, 71,6 ± 5,8 соответственно. Достоверные различия найдены между выборками родительских видов (ПП и ЛЛ), между ПП и ЛП, а также при сравнении выборок леща с выборками возвратных гибридов (ЛЛ и П*ПЛ; ЛЛ и П*ЛП), (р < 0,05). Число выявляемых локусов в геноме плотвы и леща (111 и 106) оказалось несколько ниже по сравнению с гибридными спектрами (ПЛ; ЛП; П*ПЛ; П*ЛП; ПЛ*П – 117, 110, 138, 118, 114). Суммируя данные по всем праймерам отмечено 6 мономорфных локусов из 167 выявленных (2 м. л. – Р29; 3 м. л. – ОРА11 и 1 м. л. – ОРА20). Число видоспецифических фрагментов составляет для плотвы и леща 26 и 38 соответственно. Спектры гибридов содержат фрагменты обоих родительских видов, отмечены мономорфные локусы между чистым видом и отдельной группой гибридов: 1 м. л. по ОРА11 – у плотвы со всеми группами гибридов и 2 м. л. по ОРА20 у леща с гибридами. Возможно, при дальнейшем анализе таких фрагментов, можно было бы выявить маркерный признак, который бы определял характер наследования.
Доля полиморфных локусов у плотвы и леща – 78,0 и 64,0 %, гибридов первого поколения ПЛ – 74,0 % и ЛП – 79,0 %, бэккроссов – П*ПЛ – 85,0 %, П*ЛП – 75,0 %, ПЛ*П – 74,0 %, несмотря на небольшое число представителей в выборках, все пять выборок потомков оказались высокополиморфными. При сравнении выборок родительских видов (ПП и ЛЛ) с выборками гибридов F1 (ПЛ и ЛП) по указанным коэффициэнтам (Р, N) достоверные различия найдены между ПП и ЛП. При сравнении с возвратными гибридами выявлены достоверные отличия ЛЛ с П*ЛП и П*ПЛ.
После обработки матрицы в программе Treecon получена дендрограмма генетических расстояний. Все представленные выборки группировались в два кластера, один представляла чистая плотва, второй состоял из двух субкластеров, один из которых включал все реципрокные варианты бэккроссов, а второй составили гибриды F1 и чистого леща. Значения внутригруппового сходства в выборке плотвы варьируют в пределах 0,22–0,42, леща – 0,11–0,35, гибридов F1 – 0,18–0,46, бэккроссов – 0,17–0,44. На основе полученной RAPD-анализом матрицы с помощью метод главных компонент удалось дифференцировать не только реципрокные гибриды F1, но и все реципрокные варианты бэккроссов.
Таким образом, данный набор случайных праймеров способен дифференцировать чистые виды, гибриды F1 и бэккроссов, чего не удавалось добиться биохимическими методами с помощью аллозимных маркеров.
Zoocenosis — 2007
Біорізноманіття та роль тварин в екосистемах: Матеріали ІV Міжнародної наукової конференції. – Дніпропетровськ: Вид-во ДНУ, 2007. – С. 178-180.
1