Органо-тканинний поліморфізм естераз бичка-сурмана Neogobius cephalargoides із Одеської затоки
УДК 577.152.31:597.556.31
В. В. Заморов, І. Л. Рижко, Ю. В. Караванський
Одеський національний університет ім. І. І. Мечникова, Одеса, Україна, hydrobiologia@mail.ru
ORGAN-TISSUE POLYMORPHISM OF ESTERASES
IN NEOGOBIUS CEPHALARGOIDES FROM ODESSABAY
V. V. Zamorov, І. L. Ryzhko, Y. V. Karavansky
I. I. Mechnikov Odessa National University, Odesa, Ukraine
Різні ферментні системи, у тому числі естеролітичні, широко використовуються як маркери в дослідженнях популяцій тварин. Поліморфізму естераз у риб присвячено багато досліджень, але даних про його молекулярні та генетичні основи поки що недостатньо. Дослідження бичка-сурмана Neogobius cephalargoides Pinchuk, 1976 становлять значний інтерес у зв’язку з тим, що донедавна цей вид об’єднували в одну систематичну одиницю разом із бичком-ратаном N. ratan (Nordmann, 1840). Тому залишається не з’ясованою внутрішньовидова структура цього виду. Мета даної роботи – охарактеризувати органо-тканинний поліморфізм і експресію естераз у бичка-сурмана в Одеській затоці.
Матеріалом для вивчення електрофоретичних спектрів тканинних естераз були самці та самки бичка-сурмана. Рибу виловлювали в Одеській затоці (Чорне море) в районі Малого Фонтана в літньо-осінній сезон 2008 року (120 екз.). Досліджували трирічних особин однієї розмірно-масової категорії. Рибу заморожували та зберігали до моменту проведення аналізу при температурі –20 °С. Перед експериментом матеріал дефростували, виділяли органи риб і гомогенізували їх у середовищі 0,1 М гліцин-NaOH буферу (рН 9,0) з 1 % тритоном Х-100. Приготовлені гомогенати центрифугували протягом 15 хвилин при 12 000 об./хв. на холоді, після чого отримані екстракти використовували для електрофоретичного розділення естераз, які в них містилися. У даному дослідженні для розділення білків кислої природи застосовували варіант лужного електрофорезу у системі трис-гліцинового буферу (рН 8,3) за системою Davis (1964). Розділяюча фаза носія являла собою пластинчастий блок із концентрацією поліакриламідного гелю 7 %. Перед внесенням у слоти 10 мкл зразку змішували з 5 мкл 0,01 % розчину бромфенолового синього (використовували як лідируючий барвник), що містив 60 % сахарози. Електрофорез проводили при силі струму 20 мА із розрахунку на один гелевий блок. Для виявлення молекулярних форм естераз використовували модифіковану методику, описану Л. І. Корочкіним (1977). Про місцезнаходження ферменту в гелі судили за результатами проведення в м’яких умовах (рН 7,4) реакції одночасного азосполучення. Із метою виявлення зон локалізації естераз в гелі гідроліз ефірів проводили за присутності діазонія – синього міцного RR, який вступає з нафтоловими продуктами у реакцію одночасного азосполучення, що призводить до утворення нерозчинного азобарвника. Інкубаційне середовище для фіксованого в гелі ферменту готували в 0,1 М фосфат-фосфатному буфері (рН 7,4). Субстратом був α-нафтилпропіонат. Кількісну оцінку електрофореграм проводили, використовуючи спеціальну комп’ютерну програму «АнаИС». Про експресію виявлених естераз судили за показниками оптичної щільності (ΔDo, відносні одиниці) відповідних ферментутримуючих зон гелевого блоку. Отримані первинні дані, що відображають рівень активності досліджуваних ферментів, обробляли статистично.
Для оцінки внутрішньопопуляційних процесів важливі чіткі знання з органо-тканинного поліморфізму обраної ферментної системи. Тому у наших дослідженнях порівняно поліморфізм і експресію естераз тканин різних органів бичка-сурмана: зябрових пелюсток, кістякових м’язів, кишечника, печінки та гонад. Усі виявлені на електрофореграмах ізоформи естераз за їх електрофоретичною рухливістю можна розділити на чотири групи. Перша група – найбільш електрофоретично рухлива (Rf = 0,680) і одночасно має досить невелику експресивність. Друга та третя групи у більшості органів бичків представлені двома фракціями: однією рухливішою (F) і другою менш рухливою (S). Четверту групу складають ізоформи, які мають нафтилацетазну та ліпазну активність. Це група найменш рухливих форм естераз (Rf від 0,120 до 0,150), які мають велику молекулярну масу. Інші групи естераз ліпазної активності не проявляють.
Естерази зябрової тканини представлені чотирма головними групами зі стабільними для кожного ферменту значеннями Rf. Найбільшу активність виявляла третя група, представлена двома фракціями (Rf 0,260 і 0,280). Показник оптичної щільності в данному випадку для самців і самок досягав 1,900 і 1,770 відповідно. Найменшу активність виявляла перша група ферментів. Вона – найбільш електрофоретично рухлива (Rf = 0,680), але оптична щільність не перевищує 0,273. Як і у випадку зябрових пелюсток, у м’язовій тканині виявлено чотири близькі за електрофоретичною рухливістю групи естераз. Однак необхідно зазначити, що всі фракції ферментів м’язової тканини проявляють нижчу активність (максимальне значення активності не перевищувало 0,575), а в окремих випадках представлені практично слідовими кількостями. Найбагатший за різноманіттям ізоформ досліджених ферментів – спектр гонадальної тканини. Крім фракцій, ідентичних фракціям зябрових і м’язових ізоензимів, спостерігаються й унікальні компоненти. Однак значна активність малорухливих фракцій нерідко ускладнює ідентифікацію окремих ізоформ, що позначається на якості аналізу. Необхідно зазначити, що ця тканина також зазнає суттєвих змін відповідно до віку риб, а також сезону. Тому її використання може ускладнити проведення вивчення внутрішньопопуляційної структури, а також внести значну помилку. Тканини кишечника та печінки характеризуються найвищою активністю естераз: для печінки показники активності основних форм ферментів коливалися у межах 2,220–3,100. Однак різноманіття їх значно поступається м’язам і зябрам. Зокрема, у них відсутній поділ груп естераз на дві фракції.
Як свідчать отримані дані, спостерігаються суттєві кількісні, а у випадку гонад – також і якісні відмінності ізоформ естераз у риб різної статі. У самців кругляка у переважній більшості органів спостерігається вища активність ферментів, ніж у самок. У випадку тканин гонад самок на електрофореграмах наявні лише три смуги, тоді як у спектрах гонад самців їх виявлено сім. У гонадах самок бичків третя група естераз взагалі відсутня, а решта форм представлена лише однією S або F фракцією. На відміну від самців, у тканинах м’язів самок кількість ізоформ естераз менша. В інших досліджених органах кількість форм ферменту у риб обох статей співпадає, але кількісні показники експресії дуже різняться. За винятком двох форм естераз, що належать гонадам і печінці, експресія всіх інших ізоформ естераз у особин різної статі достовірно відрізняється, причому, як правило, у самок вона значно менша.
Отримані результати дають можливість прийти до висновку, що з усіх досліджених органів найсприятливішими для вивчення внутрішньовидового різноманіття системи естераз бичка-сурмана є зяброві пелюстки. Чіткий поділ окремих ізоформ ферментів цієї тканини на шість смуг, їх висока активність, легкість ідентифікації окремих форм, їх гетерогенність за різних умов та інші чинники дозволяють вважати зяброву тканину зручною для подальшого вивчення внутрішньовидової мінливості бичка-сурмана.
Отримані результати відображають окремі біохімічні ознаки фенотипу бичка-сурмана та можуть бути використані як при здійсненні моніторингу динамічних процесів, що відбуваються у популяціях цього виду в екологічній системі Одеської затоки, так і для проведення порівняльного аналізу під час вивчення споріднених популяцій і окремих видів роду Neogobius.
Zoocenosis — 2011
Біорізноманіття та роль тварин в екосистемах: Матеріали VІ Міжнародної наукової конференції. – Дніпропетровськ: Вид-во ДНУ, 2011. – С. 78-80.
i